流式細(xì)胞儀的原理是什么
1.首先，機(jī)器吸取細(xì)胞混懸液，射入由鞘液（一般都是磷酸鹽緩沖液）。由于鞘液的流速大，所以細(xì)胞混懸液通過(guò)軸流的形式在，一般是單個(gè)細(xì)胞排隊(duì)的形式。2.然后細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)窗口。有激光束照射。一般細(xì)胞都經(jīng)過(guò)熒光染色，被激光照射后，會(huì)有不同波長(zhǎng)的激發(fā)光產(chǎn)生。機(jī)器設(shè)有檢測(cè)器來(lái)探測(cè)激發(fā)光的強(qiáng)弱
3.根據(jù)激發(fā)光的強(qiáng)弱，來(lái)判斷細(xì)胞和染色物質(zhì)的結(jié)合情況，從而得到要檢測(cè)的結(jié)果（比如抗原量，DNA量，等等）流式細(xì)胞儀可同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，信息主要來(lái)自特異性熒光信號(hào)及非熒光散射信號(hào)。
測(cè)量是在測(cè)量區(qū)進(jìn)行的，所謂測(cè)量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點(diǎn)。液流的單個(gè)細(xì)胞通過(guò)測(cè)量區(qū)時(shí)，受到激光照射會(huì)向立體角為2π的整個(gè)空間散射光線，散射光的波長(zhǎng)和入射光的波長(zhǎng)相同。散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因?yàn)檫@些生物學(xué)參數(shù)又和細(xì)胞對(duì)光線的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。
未遭受任何損壞的細(xì)胞對(duì)光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號(hào)對(duì)不經(jīng)染色活細(xì)胞進(jìn)行分析和分選。經(jīng)過(guò)固定的和染色處理的細(xì)胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號(hào)當(dāng)然不同于活細(xì)胞。散射光不僅與作為散射中心的細(xì)胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。
在流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量中，常用的是兩種散射方向的散射光測(cè)量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②側(cè)向散射（SSC），又稱90角散射。這時(shí)所說(shuō)的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說(shuō)來(lái)，前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，對(duì)同種細(xì)胞群體隨著細(xì)胞截面積的增大而增大；對(duì)球形活細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系；對(duì)于形狀復(fù)雜具有取向性的細(xì)胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測(cè)量主要用來(lái)獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，但它對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。
在實(shí)際使用中，儀器首先要對(duì)光散射信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時(shí)，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細(xì)胞。光散射測(cè)量有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。
熒光信號(hào)主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，波長(zhǎng)也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號(hào)為噪聲信號(hào)，在多數(shù)情況下會(huì)干擾對(duì)特異熒光信號(hào)的分辨和測(cè)量。在免疫細(xì)胞化學(xué)等測(cè)量中，對(duì)于結(jié)合水平不高的熒光抗體來(lái)說(shuō)，如何提高信噪比是個(gè)關(guān)鍵。一般說(shuō)來(lái)，細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細(xì)胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；細(xì)胞樣品中所含亮細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。
減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng)；③采用電子補(bǔ)償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻(xiàn)予以補(bǔ)償。
